肝癌細胞如何"銅墻鐵壁"抵抗死亡？HBV蛋白X破解線粒體銅代謝密碼

一、研究背景

慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球重大公共衛生問題，約有2.96億人處于慢性感染狀態，HBV相關肝細胞癌（HCC）每年導致超過80萬人死亡。HBV編碼的X蛋白（HBx）通過重塑宿主轉錄和信號網絡、調控多種程序性細胞死亡（如凋亡、鐵死亡、壞死性凋亡、焦亡等）促進惡性進展和治療抵抗。

銅死亡（Cuproptosis）是2022年Tsvetkov等人新近定義的一種銅依賴的、以線粒體為中心的調控性細胞死亡形式，其特征是銅離子與脂酰化的三羧酸（TCA）循環蛋白結合，引發毒性聚集并破壞鐵硫簇，選擇性殺傷線粒體呼吸依賴型細胞。銅離子載體（如elesclomol, ES）可升高線粒體銅水平觸發銅死亡，而銅螯合劑（如四硫代鉬酸鹽, TTM）則拮抗此過程。然而，HBV是否通過HBx干擾銅穩態和銅死亡以促進肝細胞癌發生發展，此前尚不清楚。

STEAP4（six-transmembrane epithelial antigen of prostate 4）是一種NADPH依賴的金屬還原酶，可將Cu2?/Fe3?還原為Cu?/Fe2?，在STEAP家族中具有最高的金屬攝取活性，是銅代謝和銅死亡敏感性的關鍵調控因子。臨床研究表明STEAP4在HCC中廣泛下調，且與晚期分期和不良預后相關。鑒于HBV感染患者血清銅水平升高，以及STEAP4在銅穩態中的核心作用，本研究旨在闡明HBx是否通過調控STEAP4介導銅死亡逃逸，并探索靶向該通路的潛在治療策略。

二、研究內容概述

1. STEAP4介導的銅代謝和銅死亡定義了HBV相關HCC的治療脆弱性

研究團隊整合GEO（GSE62232、GSE135631、GSE121248、GSE94660）、TCGA-LIHC、ICGC-LIRI-JP和CPTAC等多個公共數據庫，對127個銅代謝基因和10個核心銅死亡調控因子進行差異表達分析和基因集富集分析（GSEA）。結果顯示，HBV陽性HCC中銅代謝和銅死亡相關基因集顯著下調，交叉隊列分析鑒定出STEAP4、HAMP、MT1H和SLC46A3四個核心差異基因，其中STEAP4的ROC曲線下面積（AUC=0.924）最高，提示其作為銅穩態調控因子的診斷價值。多隊列驗證（GSE121248、GSE94660、TCGA-LIHC、ICGC-LIRI-JP、CPTAC-HCC）一致證實STEAP4在HBV相關HCC中顯著下調，且其表達與病理T分期呈負相關。臨床標本分析（12對HBV-HCC癌與癌旁組織）顯示腫瘤組織中Cu2?含量顯著升高，而STEAP4蛋白水平顯著降低。組織微陣列（TMA）和生存分析進一步證實低STEAP4表達與HBV陽性患者更差的總生存期（OS）和無病生存期（DFS）相關。綜上，STEAP4缺失是HBV相關HCC的顯著分子特征，破壞了銅穩態并削弱了銅死亡網絡。

2. 抗HBx通過上調STEAP4使HBV相關HCC細胞對ES誘導的銅死亡敏感化

在HBx轉基因（HBx-Tg）小鼠中，轉錄組學顯示STEAP4和核心銅死亡調控因子FDX1下調，GSEA證實銅代謝和銅死亡信號通路受抑制，且肝組織Cu2?隨年齡增加而升高。HBx表達的HepG2細胞整合轉錄組/蛋白質組學分析同樣顯示STEAP4一致下調，Venn交集分析將STEAP4確定為唯一的共享候選基因。功能實驗表明，HBx陽性HCC細胞系（HepG2.2.15、MHCC-97H）對ES-Cu誘導的銅死亡表現出部分耐受性。通過轉染細胞內抗HBx單克隆抗體（anti-HBx mAb）中和HBx后，細胞內Cu2?降低而Cu?升高，總谷胱甘肽（T-GSH）增加，同時FDX1、LIAS、脂酰化DLAT減少，HSP70升高，DLAT寡聚體形成增加，呈現典型的銅死亡分子特征。多種細胞死亡抑制劑（氯喹、Fer-1、Nec-1、Z-VAD-FMK等）均不能挽救ES誘導的細胞死亡，而銅螯合劑TTM可完全恢復細胞活力，證實該過程為銅依賴性銅死亡。因此，靶向HBx可恢復銅死亡敏感性，STEAP4是HBx驅動銅死亡抵抗的關鍵節點。

3. TTM逆轉STEAP4介導的ES誘導銅死亡敏感化和腫瘤抑制作用

研究團隊在HepG2.2.15和MHCC-97H細胞中建立STEAP4穩定敲低和過表達（STEAP4-OE）模型。STEAP4敲低顯著增加ES耐受性，而STEAP4過表達顯著增強ES敏感性，且該效應可被TTM完全逆轉，確立了銅依賴性機制。STEAP4-OE增加細胞內銅氧化還原通量，尤其顯著促進線粒體Cu?積累，同時升高T-GSH水平。ES處理后，STEAP4-OE細胞表現出FDX1、DLAT、LIAS及脂酰化DLAT減少、HSP70升高的典型銅死亡標志，DLAT寡聚化和焦點形成增加，這些變化均被TTM逆轉。遺傳學實驗顯示，FDX1敲除（FDX1-KO）可部分削弱STEAP4-OE的致敏效應，而STEAP4-OE也可部分緩解FDX1-KO導致的過度敏感，提示二者存在功能交叉而非簡單冗余。此外，STEAP4-OE抑制克隆形成、增強ES抗增殖活性，并上調E-cadherin、下調Vimentin，提示EMT特征減弱。綜上，STEAP4通過增強線粒體銅氧化還原重塑和誘導典型銅死亡標志，以銅依賴性方式強化ES觸發的銅死亡。

4. STEAP4協調線粒體代謝重編程以賦予HBx表達HCC細胞銅死亡抵抗

銅死亡優先殺傷線粒體呼吸依賴型細胞，而糖酵解偏向型細胞敏感性較低。HBx表達模型（HepG2細胞和HBx-Tg小鼠肝組織）的代謝組學分析顯示糖酵解/磷酸戊糖途徑（PPP）相關代謝物增加、TCA循環中間產物減少，提示代謝向糖酵解狀態轉變。STEAP4-OE的轉錄組學分析則呈現相反模式：銅代謝和銅死亡相關基因、線粒體電子傳遞鏈（ETC）復合物和TCA循環相關基因上調，糖酵解通路基因下調。GO分析顯示"電子傳遞活性正調控"、"線粒體呼吸鏈"和"4鐵4硫簇結合"通路激活；KEGG富集突出"氧化磷酸化"和"癌癥中心碳代謝"通路。透射電鏡（TEM）顯示ES處理后STEAP4-OE細胞線粒體嵴破壞、腫脹和空泡化，線粒體碎片化增加。功能上，ES顯著損害線粒體呼吸鏈復合物I-V活性，降低TCA相關代謝物、NAD?/NADH比值和ATP水平。Seahorse分析表明，STEAP4-OE提高基礎和最大呼吸速率，但ES處理后最大呼吸和備用呼吸能力顯著崩潰；同時STEAP4-OE抑制糖酵解參數。整合OCR/ECAR分析顯示STEAP4-OE使細胞全局轉向線粒體代謝依賴狀態，這種狀態對ES觸發的線粒體衰竭選擇性脆弱。因此，STEAP4將HBx陽性HCC細胞從糖酵解重編程為TCA循環/呼吸依賴，從而放大ES-Cu誘導的銅死亡脆弱性。

5. ES和STEAP4協同增強銅死亡敏感性并在體內抑制HBV相關HCC腫瘤發生

皮下移植瘤模型（MHCC-97H細胞，n=5/組）顯示，STEAP4-OE或ES單藥治療均顯著抑制腫瘤生長，二者聯合產生更顯著的協同抑制效應。聯合治療組腫瘤內Cu2?升高，TEM顯示線粒體超微結構缺陷（嵴丟失、空泡化）最顯著，ETC活性降低，TCA代謝物、NAD?/NADH比值和ATP產生減少，銅死亡和EMT標志改變最大。原位肝癌模型（HepG2.2.15-Luc細胞，n=6/組）進一步驗證，ES或STEAP4-OE單藥顯著減少腫瘤負荷、肝內結節數和局部播散，聯合治療產生穩健的協同抗腫瘤效應。綜上，STEAP4-OE通過銅死亡抑制HBV相關HCC，并與ES協同實現更優的抗腫瘤效果。

6. SIRT3介導的STEAP4去乙酰化調控其在HBx表達HCC細胞中的線粒體轉位

免疫熒光和線粒體分級分離顯示，anti-HBx中和HBx后STEAP4線粒體定位顯著恢復。通過Co-IP/質譜分析STEAP4相互作用組，GO富集顯示"糖酵解過程"、"丙酮酸代謝過程"、"線粒體"和"ATP結合"通路；PTM富集突出乙酰化相關蛋白，提示賴氨酸乙酰化調控STEAP4相互作用和亞細胞定位。煙酰胺（NAM，Sirtuin抑制劑）顯著增加STEAP4乙酰化，而HDAC抑制劑TSA作用微弱，表明STEAP4去乙酰化主要由Sirtuin軸調控。IP-MS鑒定出SIRT3（線粒體去乙酰化酶）為關鍵候選。SIRT3激動劑honokiol（HKL）減少STEAP4乙酰化并增強SIRT3-STEAP4在線粒體組分中的結合。上游乙酰轉移酶篩選將ELP3確定為STEAP4的主要生理乙酰轉移酶。鄰近連接分析（PLA）和共聚焦成像證實SIRT3與STEAP4空間鄰近，anti-HBx顯著增加STEAP4-SIRT3 PLA焦點數量。Co-IP證實anti-HBx增強STEAP4-SIRT3相互作用及其在線粒體斑點中的共定位。HBx阻斷減少STEAP4乙酰化并增強STEAP4-SIRT3復合物的線粒體關聯，表明HBx拮抗SIRT3依賴性去乙酰化從而破壞STEAP4線粒體輸入。通過STEAP4截短/缺失突變體分析，將關鍵結合區域縮小至C末端395-459氨基酸殘基。等溫滴定量熱法（ITC）直接定量證實SIRT3與STEAP4結合，缺失C末端顯著降低結合親和力。綜上，HBx通過干擾ELP3/SIRT3乙酰化開關使STEAP4趨向乙酰化，破壞其線粒體轉運，損害線粒體代謝穩態，最終增加銅死亡脆弱性。

7. STEAP4-K404去乙酰化啟動銅死亡并在原位HCC模型中增強ES療效

計算機模擬對接預測Lys333和Lys404為STEAP4中潛在的SIRT3相互作用殘基。線粒體組分SIRT3免疫沉淀物的質譜鑒定Lys404（K404）為主要乙酰化位點，且該位點跨物種進化保守。研究團隊構建了STEAP4-WT、乙酰化模擬突變體K404Q和去乙酰化模擬突變體K404R。與WT相比，K404Q表現出基礎乙酰化增加、SIRT3結合減少、線粒體定位受損；K404R則呈現相反表型。功能上，K404Q削弱ES誘導的銅死亡，而K404R顯著致敏HBx表達HCC細胞對ES的反應。原位腫瘤模型（HepG2.2.15-Luc，n=6/組）顯示，K404Q腫瘤對ES耐藥，表現為更高的生物發光信號、更大的腫瘤體積和更多的肝內結節；K404R腫瘤則對ES超敏感，腫瘤負荷顯著降低。機制上，K404乙酰化狀態決定腫瘤內Cu2?豐度和銅死亡信號：K404Q腫瘤積累更多Cu2?但表現為銅死亡抵抗特征（FDX1、DLAT、脂酰化DLAT和LIAS減少，HSP70升高），K404R腫瘤則呈現相反模式。組織病理學和IHC分析證實了腫瘤侵襲性和增殖活性的差異。綜上，SIRT3介導的STEAP4-K404去乙酰化是功能性啟動銅死亡通路和對ES產生充分治療反應的必要且充分條件。

8. Honokiol通過SIRT3-STEAP4依賴性銅死亡發揮抗腫瘤活性

Honokiol（HKL）是一種天然SIRT3激動劑，可恢復線粒體氧化磷酸化并逆轉Warburg效應。HKL處理HepG2.2.15細胞的RNA-seq顯示核心銅死亡基因（PDHB、STEAP4、LIAS、LIPT1、FDX1、DLD、DLAT）顯著上調，氧化磷酸化、TCA循環、線粒體電子傳遞鏈和鐵硫簇通路激活。PPI網絡將SIRT3-STEAP4軸定位為連接線粒體代謝與銅死亡調控的中心節點。shRNA介導的STEAP4敲低（shSTEAP4）消除了HKL誘導的SIRT3-STEAP4鄰近PLA焦點增加和線粒體STEAP4轉位。TEM顯示HKL增加線粒體質量和嵴完整性，這些益處被STEAP4敲低逆轉。Seahorse分析表明HKL增強基礎呼吸、最大呼吸和備用呼吸能力，而shSTEAP4細胞無反應；HKL抑制基礎糖酵解和糖酵解儲備也依賴STEAP4。HKL聯合ES顯著增強HBx表達HCC細胞的銅死亡，該效應被STEAP4敲低顯著削弱。HKL還抑制克隆存活和EdU摻入，增強ES抗增殖活性，上調E-cadherin、下調Vimentin。原位肝癌模型中，HKL+ES聯合方案比ES單藥產生顯著更強的抗腫瘤效果，表現為更低的生物發光信號和減弱的腫瘤進展。機制上，聯合治療升高腫瘤內Cu2?并誘導銅死亡對齊的蛋白特征，伴隨HSP70誘導；STEAP4基因敲除逆轉這些效應。綜上，HKL通過SIRT3-STEAP4軸重編程線粒體生物能量學，增強ES觸發的銅死亡，是恢復HBV相關HCC線粒體脆弱性的合理代謝輔助策略。

三、研究結論

本研究首次揭示HBx通過破壞線粒體SIRT3-STEAP4軸賦予HBV相關HCC銅死亡抵抗的分子機制。主要結論如下：

HBx-SIRT3-STEAP4調控軸：HBx抑制SIRT3表達，損害STEAP4在Lys404位點的去乙酰化，阻止其線粒體定位，導致細胞從TCA循環呼吸轉向糖酵解，降低對銅離子載體ES的敏感性。

STEAP4的代謝調控作用：STEAP4是HBV相關HCC中銅代謝和銅死亡敏感性的關鍵調控因子，其表達與患者預后密切相關。恢復STEAP4表達可將腫瘤細胞代謝從糖酵解重編程為氧化磷酸化/TCA循環依賴，從而放大銅死亡脆弱性。

治療策略：STEAP4過表達與ES聯合在體內外產生協同抗腫瘤效應；SIRT3天然激動劑Honokiol（HKL）通過恢復STEAP4線粒體定位增強ES療效，為HBV相關HCC的銅死亡導向聯合治療提供了臨床前依據。

PTM調控新機制：首次證明SIRT3直接去乙酰化STEAP4的K404位點是調控其線粒體轉位和銅死亡功能的關鍵開關，揭示了一種新的病毒利用翻譯后修飾逃逸內在細胞死亡程序的策略。

Du ZB, Wu XM, Lei JM, Cai YX, He J, Qian B, He XX, Han WH, Lu Y, Xia XG, Zheng HY, Guo DB, Yao YL, Li WG, Lin YC, Lin ZN. SIRT3 deacetylates STEAP4 to modulate cuproptosis sensitivity via mitochondrial metabolic reprogramming in HBV-related HCC. Cell Death Differ. 2026 Mar 16. doi: 10.1038/s41418-026-01713-w. Epub ahead of print. PMID: 41840161.